Cromatografia su strato sottile

TLC - Foto di Cristina GandolaLa TLC è una tecnica di cromatografia liquida piana di ripartizione solido-liquido in cui la fase liquida risale per capillarità lungo uno strato sottile di assorbente solido applicato su un supporto rigido costituito da una lastra di vetro o di alluminio. Semplice e veloce, permette l’analisi di più campioni contemporaneamente, può essere impiegata sia a scopi analitici sia preparativi.

Il campione è applicato sulla lastrina mediante un capillare che permette di porre una piccola quantità sotto forma di macchia a circa un centimetro dalla base, sopra il livello raggiunto dal solvente nella camera di sviluppo.
La lastrina viene posta in verticale nella camera facendo in modo che peschi nel solvente. Man mano che il solvente risale lungo la lastrina si ha la ripartizione del campione in base alla diversa affinità fra la fase stazionaria e quella mobile.

La velocità di risalità del solvente è determinata dalla polarità.
L’analisi viene interrotta quando l’eluente raggiunge la sommità della lastrina che viene quindi tolta dalla camera di sviluppo. Prima che l’eluente si asciughi è bene segnare a matita la linea del fronte.
Si può controllare lo sviluppo con luce ultravioletta se il composto è UV visibile. L’esame della lastra sotto UV mostrerà la posizione delle macchie di sostanze che assorbono nell’ultravioletto o la posizione delle macchie di composti fluorescenti.
Spruzzando la lastra con reattivi specifici si otterrà la colorazione di composti d’interesse.

E’ possibile confrontare fra loro le sostanze, presenti in TLC, attraverso i loro RF (Fattori di Ritardo) cioè in base al rapporto tra la distanza percorsa dalla sostanza e la distanza percorsa dal solvente.

La tecnica TLC può essere usata come metodo separativo, in questo caso il supporto rigido è in vetro in modo da permettere l’asportazione delle macchie tramite raschiamento. Il campione viene applicato sotto forma di striscia continua sulla lastra preparativa e il controllo viene applicato sotto forma di goccia con capillare in una porzione ristretta a lato del campione. Dopo lo sviluppo della lastra, le bande vengono visualizzate attraverso luce ultravioletta e differenziate con un tratto di matita.
La lastra può essere spruzzata con opportuno reattivo solo sul lato dove era stato posto il controllo, questa procedura è utile per visualizzare meglio la macchia d’interesse.
La banda d’interesse viene asportata tramite raschiamento e posta in una colonna di piccole dimensioni dove un solvente opportuno scioglie e asporta dal materiale della fase stazionaria il composto d’interesse.

Questa tecnica cromatografica presenta numerosi vantaggi poiché consente la separazione delle sostanze con rapidità e permettere l’analisi contemporanea di più campioni, usandone una quantità molto piccola. Il processo di separazione è facile da seguire e la velocità con la quale si possono ottenere i cromatogrammi rendono la cromatografia su strato sottile un mezzo utile per indagini preliminari e di routine.

La cromatografia su strato sottile può essere un metodo analitico qualitativo basato sulla valutazione dei valori degli RF delle macchie. Il maggior inconveniente è costituito dal fatto che gli RF per le diverse sostanze non sono spesso riproducibili in modo esatto, ciò è dovuto ad una serie di fattori sperimentali che devono essere perfettamente controllati come la natura dell’adsorbente e lo spessore dello strato.
L’uso di adsorbenti commerciali standard superiori a 0,15 mm e soprattutto un controllo rigoroso del tempo di essiccamento, e quindi dei tenori di umidità, sono in grado di ridurre al minimo le eventuali variazioni, inoltre l’eluente deve essere sempre del medesimo grado di purezza.
Bisogna considerare che, mentre la natura delle sostanze da analizzare sfugge evidentemente ad ogni controllo, la loro quantità non comporta alcun effetto, basta che non si superi la capacità del sistema.

Occorre anche ricordare che per una certa sostanza il valore dell’RF può essere leggermente diverso a seconda che sia stato determinato analizzando la sostanza pura o in miscela.

Quando si sospetta l’esistenza di un altro composto in una miscela, per provarne la presenza, occorre confrontare il cromatogramma con quello della miscela in esame cui viene aggiunta la sostanza pura e non con il cromatogramma della sostanza pura.

Un fattore importante è la saturazione della camera prima dell’inizio dello sviluppo della cromatografia. Si può ottenere facilmente un buon grado di saturazione collegando, con strisce di carta da filtro, il solvente, presente sul fondo della camera, con le pareti e le sommità della camera. Una completa saturazione rende più rapido lo sviluppo del cromatogramma e permette di ottenere valori degli RF più costanti, inoltre il fronte del solvente e le macchie appariranno meglio definite.