Cromatografia liquida ad alta prestazione

Cromatografo HPLC - Foto di Cristina Gandola

L’HPLC (cromatografia liquida ad altra prestazione) sfrutta pressioni elevate, ha un buon grado di risoluzione e consente di ottenere con rapidità la separazione delle sostanze. E’ una tra le tecniche cromatografiche maggiormente in uso sia in ambito industriale sia nella ricerca medica e scientifica.

L’HPLC, tecnica cromatografica diffusa, efficace e versatile, rappresenta la naturale evoluzione strumentale della cromatografia su colonna a bassa pressione e delle sue varianti, infatti le elevate prestazioni che si possono ottenere con l’HPLC ne giustificano ampiamente il nome: in pochi minuti si possono separare miscele anche molto complesse ed è possibile determinare la composizione quantitativa oltre ad ottenere informazioni sulla natura chimica delle sostanze sottoposte ad analisi.

L’HPLC è uno strumento di analisi rapido e di facile impiego che consente di indagare un ampio range di sostanze.

L’obiettivo principale di una analisi cromatografica è: ottenere una separazione completa di una miscela in tempi relativamente brevi.

Oggi è possibile realizzare questo obiettivo per un elevato numero di sostanze che copre quasi l’intera gamma dei composti chimici di maggiore interesse e impiego nei diversi settori industriali e della ricerca.

Se una specie chimica non è eccessivamente volatile ed è abbastanza stabile in soluzione e si individua il solvente adatto, esistono buone probabilità di poterla separare dalle sue miscele tramite HPLC – capace di sfruttare bene il potere solvente di entrambe le fasi per avere condizioni ottimali di separazione così da migliorare la selettività del sistema.

Fra i campi di applicazione più tipici dell’HPLC è possibile ricordare quello dei farmaci e dei polimeri, è usato ampiamente per la separazione di miscele di origine biologica e per l’analisi di ioni inorganici.

Analisi con HPLC

Il campione va opportunamente preparato affinché risulti il più limpido possibile, sciolto nel solvente migliore e ad una concentrazione idonea – nell’ordine delle ppm.
Il solvente o la miscela di solventi preparati per l’analisi vengono fatti fluire nelle apposite canule dello strumento mediante l’impiego delle pompe. Dopo aver effettuato la pulitura delle canule, portato il flusso alla velocità desiderata e verificata la linea di base è possibile selezionare il programma di analisi prescelto per il campione in oggetto e iniziare l’analisi.
Una piccola quantità di campione – nell’ordine dei microlitri – viene introdotta con un’apposita siringa nella colonna attraverso un iniettore a spirale, costituito da un occhiello metallico inserito lungo il capillare che alimenta la colonna.
Tramite una valvola, l’eluente viene incanalato nell’occhiello e così il campione si trova a essere spinto in colonna dall’eluente stesso, senza che s’interrompa il flusso di solvente.
Le pompe, collegate con i pescanti immersi nell’eluente, permettono la circolazione della fase mobile, ne mantengono il flusso e la pressione durante l’analisi.
Man mano che procede l’analisi, le diverse componenti del campione vengono separate in colonna e i rivelatori ottici registrano le variazioni d’intensità della luce di un raggio luminoso fatto passare attraverso il liquido in uscita dalla colonna e le trasformano in impulsi elettrici trasmessi ad un computer che fornisce un grafico detto cromatogramma.
Il cromatogramma riporta in ascissa il tempo espresso in minuti e in ordinata l’assorbanza espressa in mAU. Le sostanze separate sono rappresentate graficamente come picchi.

Il tempo intercorso tra il momento dell’iniezione e la comparsa del picco è detto tempo di ritenzione ed è un elemento identificativo della sostanza corrispondente a quel picco.

Gli spettri di assorbimento delle sostanze separate in colonna sono ottenuti grazie al sistema di rivelazione che è solitamente costituito da uno spettrofotometro, da un fluorimetro o da uno spettrometro di massa.

Con HPLC è possibile eseguire analisi di tipo analitico e semipreparativo:
nelle analisi di tipo analitico lo strumento serve per delineare i profili cromatografici dei campioni – ottenendo così informazioni utili sulla composizione del campione in studio e sulle sostanze d’interesse in esso contenute – mentre nelle analisi di tipo semipreparativo viene usato per separare sostanze pure attraverso la raccolta manuale delle frazioni – la raccolta dell’eluato viene eseguita in base al tempo di ritenzione (inizio della comparsa del picco) indicato nel profilo cromatografico.

Il computer collegato al sistema è dotato di appositi software che permettono di impostare il programma di analisi più idoneo e di operare un controllo sulle analisi oltre che archiviare e consentire confronti tra gli spettri ottenuti dal campione in esame e quelli presenti in libreria spettrale – si tratta di una raccolta di spettri corrispondenti a specifiche sostanze ottenuti da analisi precedentemente effettuate – indicandone la somiglianza espressa con un indice percentuale.

Separazione delle sostanze: le interazioni con fase mobile e fase stazionaria

La separazione avviene grazie alla diversa polarità delle sostanze e alla loro diversa interazione con le fasi mobile e stazionaria.
In base alla polarità si possono distinguere una cromatografia a fase normale in cui la fase stazionaria è polare e la fase mobile apolare ( o la fase stazionaria è più polare della fase mobile) e, al contrario, una cromatografia a fase inversa.

La fase stazionaria è posta in colonna e si tratta di un solido poroso costituito da particelle di dimensioni dell’ordine di μm.
La fase mobile può essere un singolo solvente o una miscela di più solventi che vengono spinti nello strumento dall’azione delle pompe.

Nel caso si utilizzi una miscela, si può avere una eluizione isocratica se la percentuale relativa dei solventi viene mantenuta costante oppure si avrà un’eluizione in gradiente di polarità se la percentuale relativa dei solventi viene fatta variare durante l’analisi – questa possibilità consente spesso di separare meglio le diverse sostanze migliorando la risoluzione e ottimizzando i tempi di lavoro.

La colonna

La cromatografia liquida ad altra prestazione permette ottime separazioni grazie all’uso di colonne di acciaio inossidabile capaci di sopportare alte pressioni.
Si usano colonne ad impaccamento estremamente compatto, lunghe da 3 a 50 cm e con un diametro di 1 – 5 mm. Le particelle della fase stazionaria, ben impaccate nella colonna, hanno granulometria compresa fra 3 e 10 micrometri pertanto il flusso dell’eluente può essere ottenuto solo esercitando una pressione adeguata mediante l’impiego di pompe.
Alle due estremità della colonna ci sono setti perforati di acciaio inossidabile, o di teflon, che servono a trattenere il materiale in essa contenuto.

Per preservare la colonna in modo che non perda prematuramente il suo potere risolutivo, è utile installare una precolonna tra l’iniettore e la colonna vera e propria con lo scopo di trattenere eventuali impurità presenti nel campione che altrimenti finirebbero nella colonna.

Oggi si tende ad usare colonne sempre più corte e di diametro stretto, con fase stazionaria di granulometria fine (3 micrometri) ma, nella pratica comune, una tipica separazione con HPLC prevede ancora l’uso di una colonna da 25 cm di lunghezza e 4-5 mm di diametro riempita con una fase stazionaria da 5 micrometri, in genere il flusso applicato è di 1 ml/minuto.

Il potere di risoluzione di una colonna cromatografica aumenta all’aumentare della lunghezza della colonna stessa e del numero di piatti teorici presenti per unità di lunghezza, ma esistono limiti alla lunghezza di una colonna in relazione all’allargamento dei picchi.
Bisogna inoltre ricordare che il numero dei piatti teorici è in relazione all’area della fase stazionaria: minori sono le dimensioni delle particelle della fase stazionaria migliore sarà la risoluzione anche se aumenta la resistenza al flusso dell’eluente.

I solventi

I solventi usati per HPLC devono essere puri, anche piccole tracce di contaminanti alterano le caratteristiche della colonna e interferiscono con il sistema di rivelazione.
Proprio per evitare che eventuali impurità danneggino lo strumento è opportuno inserire un microfiltro prima della pompa.

I solventi puri per HPLC devono essere degassati prima dell’uso, lo scopo è di evitare la formazione di bolle di gas nelle pompe.

Il solvente viene degassato mediante: riscaldamento, agitazione vigorosa con agitatore magnetico, o sottovuoto, con ultrasuoni o facendo gorgogliare elio nel recipiente che lo contiene.

Bibliografia

Cozzi R., Protti P., Ruaro T. – Elementi di analisi chimica strumentale. Ed. Zanichelli

Gandola C., aa. 2005-2006 – Gli alcaloidi di Aconitum napellus ssp. vulgare: aspetti chimici, farmacologici e tradizioni popolari. Tesi di laurea