Retinite pigmentosa: nuove speranze dalla terapia genica

Occhio - Foto di Adyna

Un nuovo approccio basato sull’uso di proteine a dita di zinco artificiali apre la strada alla terapia genica per il trattamento della retinite pigmentosa e per tutte le malattie genetiche a trasmissione autosomica dominante.

Il team di ricercatori italiani dell’Istituto Telethon di genetica e medicina (TIGEM) di Napoli, guidati da Enrico Maria Surace, ha messo a punto un sistema che sfrutta proteine a dita di zinco artificiali come repressori trascrizionali in grado di legare le regioni regolatorie del DNA che controllano il gene per la rodopsina le cui mutazioni risultano associate alla forma autosomica dominante di retinite pigmentosa (adRP).

Gli scienziati si sono concentrati sulle forme dominanti della malattia che implicano mutazioni con guadagno di funzione. Basta ricevere il gene difettoso da uno dei genitori (malato a sua volta) per sviluppare la malattia.
Queste forme di retinite pigmentosa, come del resto le malattie autosomiche dominanti in generale, sono molto difficili da trattare e rappresentano una grande sfida per i ricercatori di tutto il mondo.

“Le malattie a trasmissione autosomica dominante sono molto difficili da curare con la terapia genica perché il difetto genetico determina non l’assenza di una proteina, ma la presenza di una proteina anomala. Non serve fornire al paziente una copia del gene sano, bisogna invece cercare di “spegnere” quello difettoso e questo è molto più difficile” spiega Enrico Maria Surace.

I ricercatori del TIGEM hanno quindi pensato di creare delle proteine artificiali capaci di legare in modo specifico le regioni del DNA recanti il gene mutato per impedirne l’espressione, ma hanno incontrato grandi problemi, infatti, nel caso delle forme a trasmissione genetica autosomica dominante della retinite pigmentosa esistono più di 150 mutazioni dominanti riguardanti la rodopsina, risulta pertanto impensabile realizzare un numero così elevato di molecole allele-specifiche per silenziare ogni possibile mutazione. L’idea dei ricercatori è stata quella di mettere a punto un metodo universale, indipendente dalle mutazioni, capace di silenziare l’espressione sia degli alleli mutati sia del wild-type.

“Grazie a questa tecnologia basata su proteine artificiali che legano il DNA, siamo riusciti per la prima volta a rendere inattivo il gene alterato della rodopsina nelle cellule della retina nel modello animale: il passaggio successivo sarà fornire, insieme all’interruttore per lo spegnimento di rodopsina, anche la versione sana del gene” commenta Surace.

Lo studio, pubblicato sulla rivista EMBO Molecular Medicine, rappresenta un importante passo avanti verso la messa a punto di un promettente approccio innovativo per il trattamento di tutte le patologie causate da mutazioni con guadagno di funzione.

Le mutazioni con guadagno di funzione (gain of function) prevedono l’acquisizione di una nuova attività genica. Il guadagno può rivelarsi quantitativo (allele ipermorfo) o dare al prodotto genico una funzione diversa (allele neomorfo). Queste mutazioni determinano fenotipi dominanti anche nel caso in cui il prodotto dell’allele mutato interferisca con la funzione del prodotto normale.

Forti anche dei risultati ottenuti nella terapia genica di un’altra malattia ereditaria della vista, l’amaurosi congenita di Leber – retinopatia che provoca cecità o grave danneggiamento della vista fin dall’infanzia – i ricercatori del TIGEM contano di proseguire su questa strada e di aprire finalmente le porte della terapia genica anche alle malattie autosomiche dominanti così da poter in futuro raggiungere i risultati che si stanno ottenendo con le terapie geniche per il trattamento di molte patologie autosomiche recessive.

“Potenzialmente l’approccio messo a punto in questo studio potrebbe applicarsi a numerose altre malattie dominanti che colpiscono non solo l’occhio, ma altri organi. Penso quindi che questo risultato incoraggi a investire nella terapia genica di questa categoria di malattie genetiche rare, ancora troppo trascurate” conclude Surace.

Retinite pigmentosa

La retinite pigmentosa è la più comune forma di cecità ereditaria. Si tratta infatti di una malattia genetica che colpisce circa una persona su 3000 e determina la degenerazione progressiva della retina portando il malato alla riduzione dell’acutezza visiva fino all’ipovisione e alla perdita della vista.

Il meccanismo patogenetico alla base di questa retinopatia riguarda la degenerazione dei fotorecettori che si verifica come conseguenza di mutazioni a carico di alcune proteine importanti per la visione.
Nelle diverse forme di retinite pigmentosa sono coinvolti numerosi geni, la maggioranza dei quali codifica per proteine implicate nel ciclo della visione, e la mutazione genica più frequente riguarda il gene della rodopsina – il pigmento visivo dei bastoncelli – localizzato sul cromosoma 3 ed associato alla forma autosomica dominante (RP4).

La retinite pigmentosa è una malattia molto eterogenea, sia per come si manifesta, sia per come si trasmette da una generazione all’altra. In particolare, le forme autosomiche dominanti, che rappresentano circa il 35% dei casi, mostrano nell’uomo più di 150 possibili mutazioni del gene per la rodopsina. Questo si traduce in una elevata difficoltà da parte degli scienziati per individuare una strategia efficace di silenziamento dell’espressione genica allo scopo di mettere a punto un metodo per trattare la malattia.

Lo studio

Lo sviluppo di strategie terapeutiche per il trattamento di malattie genetiche che implicano mutazioni con guadagno di funzione si basa attualmente sulla regolazione genica post-trascrizionale cioè il silenziamento dell’RNA, ma i ricercatori del TIGEM hanno trovato un metodo alternativo che prevede la repressione della trascrizione basata su proteine zinc-finger ingegnerizzate.

I ricercatori hanno impiegato un modello murino della forma a trasmissione autosomica dominante di retinite pigmentosa per mettere a punto una serie di repressori trascrizionali allo scopo di rendere silente hRHO, il gene per la rodopsina umana espresso nei fotorecettori della retina.

Hanno usato le proteine a dita di zinco – famiglia di fattori di trascrizione – che hanno opportunamente modificato per ottenere domini artificiali realizzati appositamente per una determinata sequenza di DNA con lo scopo di controllare l’espressione di un determinato gene.

Le proteine zinc-finger artificiali contengono un dominio legante il DNA (DNA-binding domain – DBD) basato su una impalcatura di 2Cys2HisZF (un atomo di zinco coordinato da due residui di cisterna e di istidina) fusa con un dominio di regolazione della trascrizione. Il singolo dominio è dato dal ripiegamento beta-beta-alfa di circa 30 amminoacidi, stabilizzato mediante interazioni idrofobiche e la chelazione di un singolo ione di zinco.
Ogni modulo a zinc-finger riconosce inizialmente una sequenza data da 4 paia di basi di DNA, il legame avviene mediante specifici residui amminoacidici che possono essere cambiati allo scopo di ottenere moduli a zinc-finger con differenti sequenze specifiche. In base alla lunghezza della sequenza di DNA è possibile assemblare più moduli a zinc-finger.
I ricercatori hanno realizzato 10 moduli a zinc-finger ognuno composto da 3 unità a dita di zinco legate insieme mediante peptidi. Dopo averne testato la funzionalità in vitro, ne sono state selezionate 2 capaci di promuovere la repressione trascrizionale della rodopsina a livello cromosomico.

Gli scienziati hanno rilasciato a livello dei fotorecettori della retina un vettore virale contenente i repressori trascrizionali zinc-finger artificiali mirati per il promotore della rodopsina umana (hRHO-P) ed hanno osservato che questi possono reprimere la sovra-espressione transgenica di hRHO.
E’ stato inoltre osservato che la riduzione della trascrizione di hRHO mutato si associa ad una inalterata espressione del gene Rho murino endogeno così da indurre un miglioramento della malattia.

Dallo studio emerge che le proteine zinc-finger artificiali risultano interessanti sia per effettuare manipolazioni genetiche sia per lo sviluppo di terapie innovative.

Un aspetto da approfondire riguardo le proteine a dita di zinco è la possibilità di controllare i livelli di espressione mediante l’impiego di promotori inducibili.
Questo potrebbe forse essere d’aiuto nel prossimo futuro per implementare il modello in studio allo scopo di ottenere una regolazione fine dei livelli di espressione della rodopsina.

Le proteine a dita di zinco artificiali che in questo studio sono state impiegate come repressori, possono funzionare anche come attivatori (mantenendo lo stesso DBD) allo scopo di trattare malattie dominanti dovute a aploinsufficienza.

Metodi di silenziamento trascrizionali e post-trascrizionali

Il trattamento delle malattie a trasmissione autosomica dominante può prevedere un metodo di silenziamento trascrizionale – basato sulle proteine zinc-finger artificiali, messo a punto dai ricercatori del TIGEM – o un metodo post-trascrizionale come la RNA interference (RNAi).

Nella regolazione genica post-trascrizionale il silenziamento della espressione genica mira a colpire l’RNA messaggero (mRNA). Per trattare le malattie autosomiche dominanti risulta particolarmente promettente l’approccio basato sull’interferenza dell’RNA.

La RNA interference (interferenza dell’RNA, RNAi) è un tipo di silenziamento genico in cui alcuni frammenti di RNA a doppio filamento interferiscono e spengono l’espressione genica.

Nel caso della retinite pigmentosa sono stati usati sia l’approccio basato sulla RNAi sia quello basato sulle proteine zinc-finger artificiali, ottenendo risultati positivi in entrambi i casi.
Nel caso di un’altra patologia autosomica dominante, l’atassia spinocerebellare di tipo 1, è stato impiegato un metodo basato sulla RNAi per silenziare l’allele dominante.

Ciò fa pensare che entrambi i metodi possano dare buoni risultati e infatti, in base ai risultati ottenuti dallo studio dei ricercatori del TIGEM, il metodo di silenziamento trascrizionale e quello post-trascrizionale (RNAi) sono entrambi validi e possono essere impiegati uno in alternativa all’altro. Tuttavia sarà necessario effettuare uno studio comparativo per verificarne la sicurezza e l’efficacia, infatti bisogna ricordare che esistono meccanismi molecolari diversi alla base di questi due approcci: nel primo caso si tratta del legame col promotore e inibizione trascrizionale delle dita di zinco, nel secondo caso è una degradazione dell’mRNA ad opera dell’RNAi simile a quella enzimatica.

Fonte

C. Mussolino, D. Sanges, E. Marrocco, C. Bonetti, U. Di Vicino, V. Marigo, A. Auricchio, G. Meroni, E. Surace, “Zinc-finger-based transcriptional repression of rhodopsin in a model of dominant retinitis pigmentosa”. EMBO Molecular Medicine, 2011.

Si ringrazia Telethon per la collaborazione.